Wprowadzenie
Profilowanie transkryptomu metodą sekwencjonowania RNA (RNA-seq) tradycyjnie koncentruje się na informacyjnym RNA (mRNA), często poprzez wzbogacanie o sekwencje poli(A). Jednak wiele biologicznie istotnych regulatorowych RNA – w tym długie niekodujące RNA (lncRNA), koliste RNA (circRNA), małe niekodujące RNA (miRNA, siRNA, piRNA, bakteryjne sRNA) oraz RNA pochodzenia mikrobiologicznego – jest pomijanych w protokołach bazujących na poli(A). Skuteczna deplecja RNA rybosomalnego (rRNA), które może stanowić ponad 80–90% całkowitej masy RNA, jest kluczowa dla odzyskania tych nisko obfitych klas.
Zestaw Ribo-off V2 (dla bakterii, a także warianty dla człowieka/myszy/szczura lub roślin) został zaprojektowany do usuwania rRNA (zarówno cytoplazmatycznego, jak i – gdy istotne – mitochondrialnego) poprzez hybrydyzację sond, trawienie RNazą H oraz oczyszczanie DNazą I. Dzięki temu możliwe jest dużo głębsze uchwycenie RNA niebędących ani rybosomalnymi, ani poliadenylowanymi, czy też fragmentów zdegradowanych.
Techniczny mechanizm działania Ribo-off V2: kluczowe cechy
-
Zakres wejściowy: 0,01 µg – 1 µg całkowitego RNA, zarówno nienaruszonego, jak i częściowo zdegradowanego.
-
Celowane rRNA: w bakteriach – 16S, 23S i 5S; u ssaków – 18S, 28S, 5.8S, 5S oraz mitochondrialne (12S itp.).
-
Przepływ pracy: hybrydyzacja sond → trawienie RNazą H → trawienie DNazą I w celu usunięcia sond → oczyszczanie na kulkach magnetycznych.
-
Zgodność z materiałem zdegradowanym: umożliwia pracę na próbkach FFPE oraz starych archiwach RNA, w których rRNA fragmentuje się intensywnie.
Dlaczego skuteczne usuwanie rRNA jest kluczowe dla RNA regulatorowych o niskiej obfitości
-
Zakres dynamiczny – rRNA może dominować w 70–90% całkowitego RNA. Bez deplecji większość odczytów sekwencjonowania trafia w rRNA, a nie w interesujące transkrypty.
-
Złożoność i głębokość bibliotek – usunięcie rRNA zwiększa udział użytecznych odczytów, poprawiając czułość wykrywania i pokrycie transkryptów.
-
Redukcja biasu – w zdegradowanych próbkach fragmenty rRNA mogą zaburzać selekcję rozmiaru i obciążać bibliotekę.
-
Wykrywanie RNA bez ogonów poli(A) – lncRNA, circRNA i wiele RNA mikrobiologicznych nie posiada poli(A), więc protokoły bazujące na poli(A) je tracą.
-
Praca na fragmentach zdegradowanych – w próbkach FFPE ogony poli(A) mogą być ucięte, a rRNA fragmentowane. Deplecja pozwala zachować istotne sygnały.
-
Wzbogacenie wielu klas RNA w jednej bibliotece – umożliwia analizę lncRNA + circRNA + małych RNA + RNA mikrobiologicznych w jednej próbce.
Wzbogacenie poszczególnych klas RNA dzięki Ribo-off V2
| Klasa RNA | Jak pomaga deplecja rRNA | Uwagi |
|---|---|---|
| lncRNA | Usunięcie rRNA zwiększa pokrycie lncRNA, w tym antysensownych i międzygenowych. | Potrzebne głębokie sekwencjonowanie i dokładna adnotacja. |
| circRNA | circRNA nie mają poli(A), więc deplecja rRNA + random priming pozwala je uchwycić. Opcjonalne trawienie RNazą R dodatkowo wzbogaca. | Konieczne specjalistyczne algorytmy do wykrywania splicingów odwrotnych. |
| Małe RNA | Fragmenty rRNA mogą maskować sygnał małych RNA; ich usunięcie poprawia detekcję miRNA, siRNA, bakteryjnych sRNA. | Wymagane protokoły dedykowane dla małych RNA. |
| RNA mikrobiologiczne | Metatranskryptomika wymaga usunięcia bakteryjnych 16S/23S; dopiero wtedy możliwa jest detekcja rzadkich mRNA i regulatorowych RNA. | Niespójność sekwencji rRNA między gatunkami może obniżać efektywność sond. |
Zastosowania
Metagenomika / badania mikrobiomu
-
Kluczowe w metatranskryptomice, gdzie mieszają się rRNA bakteryjne, archealne i eukariotyczne.
-
Umożliwia wykrycie regulatorowych sRNA i mRNA rzadkich gatunków.
Transkryptomika nowotworów
-
Wykrywanie lncRNA i circRNA jako biomarkerów.
-
Zastosowanie w próbkach FFPE z archiwów onkologicznych.
-
Analiza mikrobiomów związanych z guzem.
Zdegradowane próbki RNA
-
Archiwa FFPE, stare próbki tkankowe.
-
Brak ogonów poli(A) → klasyczne wzbogacanie nie działa.
Sekwencjonowanie pojedynczych komórek i niskoinputowe
-
Niewielka ilość RNA wymaga maksymalnego wykorzystania głębokości sekwencjonowania.
-
Ribo-off V2 działa nawet przy 10 ng RNA.
Profilowanie rybosomów
-
Kontrolne biblioteki RNA-seq w Ribo-seq zyskują na efektywnej deplecji rRNA.
Przykładowe studia przypadków
-
Wykrywanie circRNA w tkance nowotworowej – deplecja rRNA umożliwia głębszą analizę circRNA, również w próbkach FFPE.
-
RNA zdegradowane z archiwów FFPE – odzyskiwanie sygnałów z transkryptów mimo fragmentacji.
-
RNA-seq gospodarza i patogenu – jednoczesne usuwanie rRNA gospodarza i mikroba pozwala badać interakcje.
-
Rzadkie populacje komórkowe – mała ilość RNA wymaga wysokiej efektywności deplecji.
Ograniczenia i uwagi
-
Specyficzność sond wobec różnych gatunków może być problemem w próbkach środowiskowych.
-
Możliwe straty niskiej obfitości RNA podczas oczyszczania.
-
Random priming wprowadza bias.
-
Konieczność dużej głębokości sekwencjonowania dla rzadkich RNA.
Wskazówki praktyczne
-
Kontrola jakości RNA (RIN, stężenie).
-
Minimalizacja strat przy pracy z małą ilością RNA.
-
Dodatkowe trawienie RNazą R dla circRNA.
-
Frakcjonowanie rozmiarowe przy małych RNA.
-
Dostosowanie protokołów do RNA zdegradowanego (krótsze fragmenty).
Kierunki rozwoju
-
Rozszerzone zestawy sond obejmujące większą różnorodność taksonomiczną.
-
Integracja z sekwencjonowaniem długich odczytów (PacBio, ONT) dla pełnych lncRNA i circRNA.
-
Zastosowania w sekwencjonowaniu przestrzennym i pojedynczych komórek.
Podsumowanie
Ribo-off V2 umożliwia skuteczne usuwanie rRNA nawet przy niskim wejściu lub w próbkach zdegradowanych. Dzięki temu możliwa jest wzbogacona detekcja:
-
lncRNA,
-
circRNA,
-
małych RNA,
-
RNA mikrobiologicznych.
Technologia ta jest szczególnie istotna w metagenomice, transkryptomice nowotworów, badaniach na zdegradowanym RNA, sekwencjonowaniu krzyżgatunkowym, pojedynczych komórkach oraz w profilowaniu rybosomów. Skuteczna deplecja rRNA zwiększa zakres dynamiczny, złożoność bibliotek oraz czułość wykrywania, otwierając drogę do pełniejszego zrozumienia regulacyjnych warstw transkryptomu.